Comece a usar a outra metade do seu sequenciador

Seu sequenciador faz muito mais que sequenciar.  A Análise de Fragmentos através de eletroforese capilar é uma técnica que permite a detecção do tamanho de fragmentos amplificados por PCR, utilizando iniciadores marcados com fluorescência. Esta técnica é usualmente empregada na análise de microssatélites, para os estudos de identificação de marcadores moleculares de doenças, estudos populacionais, determinação de paternidade, genética forense, etc. A eletroforese capilar substitui sistemas de detecção como os géis de poliacrilamida e até mesmo o gel de agarose, facilitando e simplificando o trabalho através de um sistema automatizado para a eltroforse e um conjunto de softwares para análise dos resultados, diminuindo os vieses associados à análise de fragmentos.

Muitas outras técincas utilizam a análise de fragmentos como princípio, como por exemplo, o SNaPshot, usada na genotipagem de SNPs. Os SNPs são polimorfirmos de nucletídeo único, cuja frequência, no genoma humano, é de cerca de 1 a cada mil pares de base. Muitos SNPs contribuem para as diferenças fenotípicas interindividuais, susceptibilidade a doenças e a resposta ao uso de medicamentos (farmacogenômica e famacogenética).

Fig. Princípio da técnica de SNaPshot

A técnica de SNaPshot® é baseada na extensão de um único nucleotide marcado com fluorescência (ddNTP), utilizando iniciadores não marcados. Nesta técnica, a região contendo o(s) SNP(s) a serem avaliados é amplificada por PCR e o produto de PCR  é submetido a uma reação de SNaPshot, na qual um primer hibridiza na região justaposta ao SNP e o dideoxinucleotídeo (ddNTP) complementar é incorporado pela polimerase. Após a reação de SNaPshot o produto é misturado com a formamida e o size standard e submetido á eletroforese capilar para identificação do ddNTP incorporado. Através desta técnica, é possível genotipar até 10 SNPs previamente descritos em uma reação multiplex. Os primers para os doferentes SNPs diferem em tamanho através da adição de uma cauda (poli A, poli T, etc) à extremidade 5`.   O genótipo de cada SNP é determinado pela cor observada, após a reação de SNaPshot.

Fig. Exemplo de dado de SNaPshot®

O SNaPshot é uma técnica robusta, que utiliza o princípio do sequenciamento de Sanger (incorporação de um ddNTP pela DNA polimerase), e que permite ao pesquisador analisar mais de 23 mil SNPs por dia em uma única plataforma 3730xl.

Análises de BAC fingerprinting e metilação também podem ser realizadas usando o sistema SNaPshot ®.

Leia mais sobre genotipagem de SNPs em: SNP genotyping

Além disso, a Análise de Fragmentos também é utilizada em outras aplicações como: AFLP, MLPA, Perda de Heterosigozidade (LOH), T-RFLP, SSCP, etc, que são usadas em diferentes áreas da pesquisa e diagnóstico clínico, confira no site da Life Technologies:

Sample Type	Research Type	Diagnostic Tool
DNA Fragment Analysis	Epigenetic Analysis	IVD Instruments
RNA Fragment Analysis	Cancer Research	Pathogen Detection
	Genetic Disease Research	Transplant Diagnostics
	Agriculture Biology Research
	Pathogen Detection and Analysis
	Food Testing
	Human Identification (HID)
	HLA Typing

AFLP é uma técnica de alta sensibilidade na qual o DNA genômico do organismo de interesse é digerido com enzimas de restrição e ligado a adaptadores para posterior amplificação utilizando primers que são complementares aos adaptadores e que são marcados com uma fluorescência. Através dessa técnica é possível identificar padrões de bandas (fingerprints) para um determinado indivíduo, dado que pode ser usado, por exemplo, para uma comparação com o perfil observado em outros individuos, com o intuito de determinar o grau de parentesco entre os mesmos. Alem disso os dados de AFLP também podem ser usados para monstar mapas genéticos de novas espécies, estudos moleculares filogenéticos, estudos de ligação, etc.

Fig. Workflow da técnica de AFLP

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) é uma técnica de PCR multiplex, que utiliza o princípio da análise de fragmentos para avaliação dos resultados. Muito usada no estudo de disturbios congenitos e hereditários que envolvem variações no número de cópias de alguns genes, como as sindromes, essa técnica baseia-se na hibridização e ligação de sondas alvo-específicas, seguida pela amplificação por PCR usando primers marcados com fluorescência, que são complementares a sonda. Essa técnica também é usada em estudos de metilação do DNA, quantificação de RNA mensageiro (mRNA), perfil tumoral, etc.

Fig. Workflow da técnica de MLPA

Leia mais sobre os fundamentos da análise de fragmentos e tenha acesso a literatura especializada no site: Fragment Analysis - Life Technologies

Para mais informações sobre a técnica de MLPA, visite o site da MRC-Holland, detentora da patente desta tecnologia: MLPA - MRC-Holland

A Importância da Tipificação HLA

A região do MHC (Complexo Principal de Histocompatibilidade) está localizada no braço curto do cromossomo 6 e possui os genes que codificam as moléculas HLA (Antígeno Leucocitário Humano). O MHC é uma das regiões mais polimórficas do genoma humano e a genotipagem (ou tipificação) de indivíduos para os genes HLA é importante em muitas áreas da medicina e da pesquisa básica, tais como:

•         Transplantes;

                -medula óssea

                -órgãos sólidos

                -estudo de ligação com KIR

•         Associação com doenças;

•         Farmacogenética (resposta a medicamentos);

•         Estudos de frequências populacionais;

•         Antropologia e migrações humanas.

O transplante alogênico de medula óssea é o tratamento de escolha para muitas doenças hematológicas, tais como:

•         Leucemia

•         Aplasia medular

•         Mieloma múltiplo

•         Hemoglobinopatias

O sucesso do transplante de medula é dependente de vários fatores, incluindo o estágio da doença quando ocorre o transplante, o regime de condicionamento, a fonte de células tronco hematopoiéticas e o grau de identidade HLA entre doador e receptor.

A compatibilidade nos transplantes de medula é mais difícil, pois a  análise é feita em ALTA RESOLUÇÃO, ou seja, é preciso identificar os dois alelos específicos do doador e do receptor, e não apenas os grupos alélicos, que é o que acontece em baixa resolução.

Porquê sequenciamento é o padrão ouro para tipagem HLA em alta resolução?

•         A fronteira final da resolução

−        Você visualiza seu alelo base por base.

•         Resolução em 2, 4 ou até 6 dígitos na mesma reação

−        Sequências acessórias com os GSSPs (máxima definição)

•         Geração de dados por definitivo

−        Resultados não são modificados por atualizações e desenhos de sondas.

•         Fim dos problemas em relação a alelos raros

−        Resultados não são baseados em similaridade de sequência (comum em SSP e SSO)

•         Possibilidade de identificação de alelos nulos e novos alelos

Caso a mutação esteja presente nos éxons que você está analisando

A Invitrogen/Life Technologies comecializa os Kits SeCore®, que utilizam a química BigDye®, para o sequenciamento HLA. Estes kits oferecem as seguintes vantagens:

• Arquivos de dados analisados com software ABI;
• Sequenciadores Applied Biosystems já incluem calibração espacial e espectral para BigDye®;
• Maior resolução e qualidade.

Fig. Genotipagem HLA com BigDye: melhor proporção de altura e distância entre os picos

Além disso, os kits Secore para tipagem HLA em alta resolução baseada em sequencia oferecem:

• Único programa de ciclagem para todos os loci, reduzindo erros de manuseio de amostras e melhorando a eficiencia.
• Amplificação curta, apenas 1,5 h – possibilitando amplificação e sequenciamento no mesmo dia.
• Identificação alélica robusta para todos os loci e picos de alelos balanceados para identificação de heterozigozidade.
• Ampla lista de kits GSSP (Group Specific Sequencing Primers) para resolução de ambiguidades.

A estratégia Secore começa com a amplificação do locus alvo através de mix de amplificação, Taq DNA Polimerase Fast Start e amostra de DNA genomico. O produto resultante é tratado com ExoSAP-IT antes do sequenciamento, para degradar primers não incorporados e hidrolizar nucleotídeos livres. A sequencia de nucleotideos e o subtipo HLA resultante é determinado por sequenciamento multicolorido baseado em fluorescência. As reações finais são purificadas através de uma precipitação com etanol antes da leitura. As amostras desnaturadas são carregadas e os resultados detectados em um instrumento de sequenciamento automatizado.

Cada kit Secore inclui:

• Primers loci especificos
• Taq DNA Polimerase Fast Start
• Enzima ExoSAP-IT
• Mix de sequenciamento (primers, corantes, terminadores e polimerase)
• Tampão de precipitação

O software U-Type

É o software utilizado para a análise dos dados. O Software faz o base calling das amostras, montagem da sequencia consenso e identificação contra uma biblioteca das sequências dos alelos descritos de cada loco.

O Software U-Type também sugere kits GSSP que podem ser usados na resolução de ambiguidades, quando essas são observadas. Estes kits utilizam a técnica de SSP para resolver situações em que dois ou mais gonótipos igualmente prováveis são sugeridos para o mesmo indivíduo.