A metilação do DNA é um dos mecanismos mais importantes para a regulação da expressão gênica. Perfis de metilação estão associados não apenas aos diferentes tipos celulares e tecidos e à idade do organismo, mas também às condiçoes fisiológicas deste organismo.
As regiões metiladas geralmente estão associadas as reigões promotoras dos genes, formando domínios que são conhecidos como ilhas CpG. Essas ilhas, qaundo metiladas, promovem o silenciamento gênico. A metodologia tradicional para análise de regiões metiladas envolve o tratamento do DNA com bissulfito, que promove a conversão de todas as citosinas não metiladas em uracilas. A identificação das citosinas metiladas e não metiladas nos sítios CpG pode então ser realizada por PCR Metilação-Específica, ou, mais frequentemente, por sequenciamento. O nível de metilação das regiões genômicas de interesse também pode ser determinado por análise de fragmentos ou através da construção de uma curva de dissociação (HRM).
O methylSEQr™ Bisulfite Conversion Kit é uma excelente opção para conversão do DNA por bissulfito.
Existem outras abordagens que podem ser utilizadas, como por exemplo a seleção de regiões metiladas através do uso de kits capazes de capturar essas regiões, como por exemplo o MethylMiner™ Methylated DNA Enrichment Kit. As regiões capturadas podem, posteriormente, ser analisadas de diversas maneiras, incluindo sequenciamento e análise de fragmentos.
O desenho dos primes para a análise de metilação é um dos passos mais críticos da metodologia, tanto quando se pretende analisar a metilação pelos métodos tradicionais, como a PCR Metilação-Específica, como por sequenciamento e análise de fragmentos.
Para a análise de metilação por sequenciamento ou análise de fragmentos os primers para amplificação precisam ser posicionados em regiões flanqueadoras do segmento que se pretende avaliar e não é recomendado que contenham sítios CpG. Além disso, também é recomendado que os primers contenham o maior número possível de Cs (fora dos sítios CpG), para que amplifiquem especificamente o DNA convertido por bissulfito.
O software Methyl Primer Express é uma ferramenta gratuita e bastante útil para projeção e avaliação dos primers para estudos de metilação. Faça o download para seu computador.
Para saber mais sobre os estudos de metilação em diferentes organismos acesse o banco de dados: http://www.methdb.de/
(MethDB - the database for DNA methylation and environmental epigenetic effects)
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Veja a seguir alguns problemas que podem ocorrer na análise de metilação por sequenciamento
1. Picos alargados
Fragmentos com conversão parcial das citosinas migram de forma desigual e promovem distorções nos picos. Otimizar a conversão por bissulfito pode ajudar a resolver este problema.
2. Conversão parcial do DNA
A conversão parcial por bissulfito pode levar a ocorrência de picos sobrepostos ao longo de toda sequência.
3. Picos duplos no inicio da sequência
Esse perfil deve-se a formação de dimeros de primer e sua amplificação durante a PCR. A utilização de polimerases com sistema "hot start" pode diminuir esse problema. Caso contrário, redesenhe seus primers.
4. Picos específicos sob bases específicas
Quando sequências tratadas com bissulfito são analisadas usando o ABI basecaller, o software pode supercalibrar para a ausência de picos de citosina.
5. Picos duplos após sequência repetitiva
Regiões repetitivas promovem instabilidades durante a amplificação devido a dificuldade da polimerase em sintetizar através dessas regiões. No eletroferograma observam-se picos sobrepostos após a região repetitiva.
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