Muito embora muitos possam confundir, a reação de sequenciamento não é uma PCR, apesar de também basear-se no princípio de cópia do DNA in vitro, utilizando uma DNA polimerase. Tanto isso é verdade, que o sequenciamento foi desenvolvido pelo menos seis anos antes da PCR.
A PCR impulsionou o estudo por sequenciamento de regiões específicas do DNA, entretanto, ainda hoje é possível fazer sequenciamento, sem utilizar uma reação de PCR previamente. Todos os grandes projetos genoma foram desenvolvidos sem a utilização da PCR, através da clonagem do DNA genômico fragmentado.
Você sabe quais as principais diferenças entre a reação de sequenciamento e a PCR?
A principal diferença é o fato de a PCR ser uma amplificação exponêncial do DNA, enquanto que a reação de sequenciamento é uma amplificação linear, pois apenas uma das fitas é utilizada como molde para cópia (apenas um primer é adicionado a reação e não um par de primers como na PCR).
PCR
Reação de Sequenciamento
Além disso, na reação de sequenciamento é utilizada uma mistura de deoxinucleotídeos (dNTPs) e dideoxinucleotídeos (ddNTPs), enquanto que na PCR são utilizados apenas dNTPs. Os ddNTPs são marcados com moléculas fluorescentes e, quando incorporados pela polimerase à molécula crescente de DNA, levam à interrupção do seu alongamento, pois possuem a extemidade 3' modificada.
Modelo esquemático mostrando as diferenças entre uma molécula de dNTP e uma de ddNTP.
Leia os discursos dos vencedores do Prêmio Nobel de Química de 1980, Frederick Sanger, pelo desenvolvimento da técnica de sequenciamento, e de 1993, de Kary B. Mullis, pelo desenvolvimento da PCR.
Leia os discursos dos vencedores do Prêmio Nobel de Química de 1980, Frederick Sanger, pelo desenvolvimento da técnica de sequenciamento, e de 1993, de Kary B. Mullis, pelo desenvolvimento da PCR.
