A utilização de bons primers na sua PCR e sequenciamento pode facilitar a obtenção de bons resultados. Abaixo você encontra algumas informações que podem ser úteis na hora de projetar e sintetizar seus primers.
Recomendação | Comentários |
Certifique-se que seus primers tenham uma Tm>45 °C. | Temperaturas muito baixas podem resultar em falhas na reação de amplificação. |
Certifique-se que seus primers tenham pelo menos 18 bases de tamanho. | Primers muito curtos geralmente tem Tms muito baixas. |
Certifique-se que seus primers são específicos para o fragmento de interesse. | Hibridação em regiões inespecíficas pode amplificar mais de um fragmento na PCR e resultar em picos duplos na sequência . |
Certifique-se que seus primers não contêm regiões repetitivas, especialmente 4 ou mais Gs. | Primers com regiões repetitivas são dificeis de sintetizar, além de aumentar a proporçao n+1 e n-1. |
Escolha primers com 50-55% de conteúdo G-C. | Pode facilitar a obtenção de primers com uma Tm ótima. |
Certifique-se que seus primers não formam estruturas secundárias ou grampos. | Dimeros de primer podem resultar em falhas na amplificação, além de levar a obtenção de picos duplos no início da sequência. |
Purifique seus primers por HPLC, para reduzir a quantidade de primers n-1. | Contaminantes resultantes da sinteze dos primers podem causar problemas na reação de PCR e amplificação e levar a resultados duvidosos. |
A utilização softwares para a projeção e avaliação dos primers pode facilitar a obtenção de bons primers. Uma boa opção de software gratuito é o Primer 3. Confira!
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Para facilitar seus experimentos e aumentar a qualidade das suas sequências utilize primers com cauda M13, veja como é fácil: BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit.