sexta-feira, 21 de março de 2014

Os desafios ao trabalhar com RNA-seq

Você já trabalha ou gostaria de trabalhar com análises de transcriptoma? O Transcriptoma é o conjunto total de RNAs transcritos em uma célula, um tecido, uma condição fisiológica, etc. Em um primeiro instante você pode se assustar com o termo transcriptoma, ou se deparar com a falta de informações na literatura, pois as análises de expressão gênica global usando o Sequenciamento de Nova Geração são um campo de pesquisa ainda em desenvolvimento dentro da biologia molecular. Por outro lado, não há duvidas que seu uso será cada vez mais abrangente. Suas vantagens em relação a metodologias tradicionais de análise da expressão gênica em larga escala são enormes, pois além de identificar os diferentes níveis de expressão, podemos:
a)    Identificar transcritos raros e ainda não conhecidos
b)    Identificar novas variantes de splicing
c)     Identificar eventos de fusão gênica e quimeras
d)    Genotipar SNPs
Apenas para citar alguns.

Fig. 1 – Diferentes tipos de RNAs expressos em uma célula. Em mamíferos, em torno de 98% dos RNAs expressos não codificam proteínas. Fonte: Interna.

Mas para alcançar estes beneficios, existem alguns detalhes importantes ao trabalhar com amostras de RNA.

Nesta série de posts que faremos, gostaria de compartilhar com vocês os principais passos para se chegar num bom resultado nos trabalhos com RNA.

1.    Qualidade da Amostra

Não há duvida que, assim como para os trabalhos com DNA, a qualidade das amostras de RNA é o primeiro passo para um bom resultado e uma análise confiável. Para obter um RNA de qualidade é indispensável escolher a metodologia de extração que mais se adequa às condições da sua amostra, podem ser kits comerciais, soluções caseiras, não importa, o que importa é a qualidade do material extraído, que alem de não estar degradado, precisa estar livre de inibidores, como proteínas e solventes orgânicos, que podem influenciar as etapas posteriores.

As moléculas de RNA são por natureza muito mais instáveis que o DNA, e sofrem degradação bastante acelerada se não preservadas da forma adequada. Preservar a integridade do RNA é extremamente crítico para construir uma boa biblioteca e produzir resultados confiáveis. Neste ponto é praticamente indispensável o uso do Bioanalyzer (ou equipamento similar) para verificar a integridade do RNA, o tão conhecido RIN (RNA Integraty Number). Para uma análise de RNAs mensageiros e outros RNAs longos (ao que normalmente nos referimos como Transcriptoma) é ideal que as amostras tenham um RIN igual ou superior a 8, enquanto que para análises de RNAs pequenos, que normalmente chamamos de miRNoma,  um RIN de 6 – 7 seria o mínimo aceitável.

Fig. 2 – Eletroferograma mostrando amostras de RNA total íntegro (RIN 10) e extremamente degradado (RIN 2). Fonte: https://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-1165EN.pdf.

Neste ponto você pode se perguntar: ”Bem, se eu preciso fragmentar o RNA durante o preparo da biblioteca, por que eu não posso usar um RNA já fragmentado?”. A resposta pode até parecer simples demais, mas é  algo que realmente precisa ser levado em consideração. Um RNA que já está naturamente degradado dificilmente sofreu uma degradação inteiramente aleatória e, certamente, isso se refletirá em um viés de análise no final do processo, com uma representação alterada dos diferentes RNAs presentes na amostra inicial.

Há ainda um outro ponto bastante crítico relacionado à amostra inicial, que é a quantificação do RNA. Enquanto a praticidade e o custo reduzido nos tendenciam a usar o Nanodrop (ou equipamento similar), é preciso ter em mente que os espectofotômetros, de forma geral, extrapolam as quantificação, pois mensuram não apenas o RNA, mas também o DNA e outras moléculas presentes na solução. Não é raro vermos uma superestimativa de até 10X em muitas amostras. Tendo isso em mente, a melhor alternativa para quantificação do RNA, assim como do DNA e Proteínas, é a fluorometria, como o Qubit, que usa um corante específico para cada tipo de molécula a ser quantificada (RNA, DNA e Proteína), garantindo a especificidade da quantificação. Por outro lado, o uso do Nanodrop não está dispensado, com ele é possivel avaliar a qualidade da amostra através das relações 260/230 e 260/230, que podem indicar a presença de proteínas e solventes orgânicos. Esta triangulação - Bioanalyzer x Nanodrop x Qubit - é peça chave para os trabalhos com RNA.

Tendo analisado a qualidade do RNA total, é preciso agora depletar o RNA-ribossomal, que representa de 90 a 95% de todo o RNA presente nas células humanas, por exemplo. A quantidade de rRNA é muito grande, e, sem um tratamento para eliminá-las, serão produzidos apenas resultados desses rRNAs. A depleção do RNA ribossomal pode ser feita através de kits como o Ribominus . Outra estratégia é isolar apenas o mRNA, usando, por exemplo, kits do tipo poli-A. Life Technologies tem ótimas soluções para vários tipos de amostras. 

Independente de usar um kit para depleção do rRNA ou um kit que isola os mRNAs a partir da sua cauda poli-A, ou mesmo ter interesse apenas nos microRNAs, é sempre recomendado fazer a extração do RNA total inicialmente, pois é apenas com o RNA total que podemos acessar o RIN. Depois desta análise inicial do RIN podemos seguir com o protocolo de depleção ou enriquecimento dos mRNAs ou microRNAs e quantificar com o Qubit para iniciar o preparo da biblioteca, observando atentamente todos os passos do protocolo, que já foi extensivamente validado.

Para mais informações sobre RNA-seq, veja as publicações abaixo e acesse a página da Life Technologies. Você pode escolher entre as plataformas Ion Torrent  PGM e Ion Proton, de acordo com a complexidade do seu organismo modelo.

RNA sequencing - advances, challenges and opportunities - 2010.pdf
Transcriptome analysis using next-generation sequencing - 2013.pdf

segunda-feira, 10 de março de 2014

Primers Pré-desenhados para Sequenciamento Capilar

Você tem dificuldades para desenhar bons primers para sequenciamento por eletroforese capilar? Um bom primer é o sucesso do seu trabalho.
Que tal optar pro primers já desenhados e garantir seus resultados?
Conheça a nossa ferramenta Primer™ Designer Tool e escolha entre mais de 300 mil pares de primers.
Para realizar a busca, é possível colocar a sigla ou nome do gene no quadro Target information; ou inserir a posição da região; ou ainda carregar uma sequência FASTA.
Para ter acesso a esta ferramenta incrível, certifique-se de que está conectado à pagina da Life Technologies US. Estamos trabalhando para torná-la disponível no Brasil, mas por enquanto ela pode ser acessada diretamente na pagina dos Estados Unidos.
Escolha seu par de primers e contacte o seu representante da Life Technologies para fazer o pedido.
Conte conosco. Garanta seus resultados.

sábado, 19 de janeiro de 2013

Sequenciamento de Sanger - Uma técnica padrão ouro

Consolidado por mais de 35 anos de uso, o sequenciamento de DNA pela técnica de terminação enzimática, também conhecido como sequenciamento de Sanger, é uma técnica cada dia mais corriqueira em laboratórios de pesquisa e diagnóstico, e sua demanda só tende a aumentar com a popularização das plataformas de sequenciamento em larga escala, quer seja para validação dessas técnicas ou mesmo para um teste rápido e simples para o diagnóstico de um alvo identificado nas análises em larga escala.
Conheça um pouco mais dessa técnica que permitiu o sequenciamento do primeiro genoma humano e a identificação de inúmeros genes envolvidos em doenças graves. Faça o download do Guia de Sequenciamento de DNA por Eletroforese Capilar da Life Technologies. 
Se você já é usuário, saiba como melhorar seus resultados a partir das dicas contidas nesse guia. Se ainda não é, não perca tempo.

Guia do usuário para Análise de Fragmentos por Eletroforese Capilar

Aprenda como explorar toda a potencialidade do seu sequenciador de DNA.
A técnica de Análise de Fragmentos de DNA por Eletroforese Capilar tem muitas aplicações na biologia molecular. Que tal genotipar até 10 SNPs em multiplex por de uma técnica gold standard, ou então identificar os grupos de oligossacarídeos ligados as suas proteínas de interesse, ou ainda fazer uma análise da expressão gênica em larga escala por uma metodologia muito simples e rápida?
Aprenda mais sobre as aplicações da Análise de Fragmentos fazendo o download do Guia de Análise de Fragmentos da Life Technologies. É gratuíto.
 

Conheça todos os produtos da Life Technologies para seu Sequenciador de DNA

Não sabe qual polímero comprar para se sequenciador, está em dúvida sobre qual é o melhor kit de sequenciamento para suas amostras?
Acesse o site da Life Technologies e faça o download do Catálogo de Produtos para Eletroforese Capilar e fique por dentro de todas as novidades e opções para seu sequenciador de DNA.

segunda-feira, 19 de novembro de 2012

Uso de 6 Dyes por amostra na Análise de Fragmentos?


Clientes dos sequenciadores 3500 e 3500xL já podem multiplexar 5 cores (+ o size standard) na Análise de Fragmentos de DNA. A Life Technologies lançou recentemente uma série de novos fluoróforos que podem ser usados na marcação de oligonucleotídeos para as aplicações de Análise de Fragmentos e PCR em tempo real. Entre esses novos dyes, está o SIDTM, cujo espectro de emissão está na faixa do roxo, e permite a multiplexação de até seis cores por amostra.
Para acelerar seus resultados basta solicitar a síntese dos primers marcados com as novas fluorescêscias e calibrar seu equipamento para a nova combinação de dyes, usando a matriz DS-36 (filtro J6), comercializada pela Life Technologies. Essa nova matriz calibra o equipamento para as seguintes cores:
6-FAMTM
VICTM
NEDTM
TAZTM
SIDTM
LIZTM
As Fluorescências e TAZTM  e SIDTM são comercializadas pela Life Technologies através de um formularios customizado. Solicite ao seu representante.

Para mais informações acesse: Windows® 7 system upgrades
Para clientes de 3500 e 3500xL não é necessário nenhum upgrade de equipamento ou software, basta a calibração espectral do equipamento. Já clientes das plataformas 3130/3130xL e 3730/3730xL precisam atualizar a versão do Data Collection para a versão 4.0. Essa atualização de software é um upgrade pago, pois requer a troca do computador do equipamento.
Para clientes HID, essa nova combinação de cores possibilita o uso do novo kit forense da Life Technologies, o GlobalfilerTM, com 24 marcadores. Entretanto, o uso do GlobalfilerTM, exige o upgrade do software GeneMapper ID-x. Para mais informações cantate o seu representante da Life Technologies.


segunda-feira, 24 de setembro de 2012

Soluções da Life Technologies para o sequenciamento de regiões problemáticas

Você já se deparou com sequências que não consegue ler completamente no seu sequenciador de DNA? Por exemplo sequências ricas sem conteúdo GC e sequências homopolímericas? (Figura 1). Esse tipo de sequência dificilmente é analisado com confiabilidade quanto se faz uma reação de sequenciamento tradicional, usando o BigDye v3.1 ou o BigDye v1.1, sem qualquer aditivo ou modificação. A DNA polimerase desses kits de sequenciamento tem propriedades intrínsecas que dificultam a sua performance através dessas regiões do DNA e levam a falhas na amplificação.
Figura 1. Cromatograma mostrando uma região rica em bases G, na qual a polimerase tem dificuldade amplificar o DNA, impossibilitando a leitura da sequência nessa região. 
Para melhorar a performance do sequenciamento dessas regiões, a Life Technologies comercializa algumas soluções que podem facilitar o seu trabalho e melhorar os seus resultados. Se o seu problema em sequenciamento é causado pela existência de repetições de bases G, que tal experimentar o dGTP BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kit (Figura 2). 
Figura 2. Região problemática para o sequenciamento tradicional (cromatograma superior), mas que pode se analisada usando o BigDye dGTP (cromatograma inferior).
Veja algumas características desse kit:

  • Otimizado para sequenciamento de regiões GT- e G-rich;
  • Uso da AmpliTaq® DNA Polymerase, com melhor performance;
  • Substitui dITP por dGTP.
Já se o seu desafio é o sequenciamento de regiões homopoliméricas, principalmente ricas em conteúdo AA e TT (Figura 3), nosso dRhodamine DyeTerminator Cycle Sequencing Kit é a solução recomendada. Veja algumas características desse Kit são:

  • Otimizado para sequenciamento de regiões homopoliméricas (AA´s, TT´s, etc);
  • Uso da AmpliTaq® DNA Polymerase, com melhor performance;
  • Menor background.

Figura 3. Região rica em repetições AA e TT, que pode ser lida com maior facilidade usando o  dRhodamine DyeTerminator Cycle Sequencing Kit.
Opcionalmente, você ainda pode usar SEQUENCERx Enhancer, um um co-solvente que facilita o sequenciamento de regiões ricas em GC, repetições diretas ou invertidas, hairpins e/ou curtas repetições de nucleotídeos. Veja algumas das suas características:


  • Adicionado ao mix de reação - protocolos tradicionais de termociclagem da reação de sequenciamento;
  • Melhora o sinal de regiões problemáticas. Aumenta o tamanho das leituras nessas regiões;
  • Compatível com as químicas  BigDye terminator v3.1 e v1.1 em todas as plataformas de sequenciamento.