A técnica de sequenciamento é uma das técnicas moleculares mais confiáveis, pois dispomos de ferramentas de bioinformática que permitem verificar a qualidade de todas as bases que constituem a sequência em estudo. Os dados gerados pela técnica de sequenciamento, além de permitirem a identificação de novas mutações, servem como parâmetro para a elaboração e a avaliação de outros métodos moleculares empregados no estudo dos mesmos genes, como por exemplo, a PCR-SSP (Polymarase Chain Reaction - Sequence Specific Primer), PCR-SSOP (Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotide Probe) e até mesmo para o desenvolvimento de ensaios específicos, como os ensaios TaqMan®, para estes genes.
O primeiro passo para obter bons resultados de sequenciamento é uma boa extração de DNA. Um DNA puro e integro é fundamental. Dentre os diversos protocolos de extração e purificação de ácidos nucleicos, os Kits da linha PureLink™ Genomic DNA, da Invitrogen, permitem a obtenção de material de alta qualidade. Já o método TRIzol® Plus, que combina o método orgânico com a purificação por colunas, também da Invitrogen, permite a obtenção de grandes quantidades de material, além de uma excelente qualidade.
Tendo um bom DNA genômico extraído, você consegue otimizar um bom protocolo de PCR, que proporcione especificidade e quantidade suficiente de DNA para a reação de sequenciamento. Nessa etapa, a purificação e a quantificação do produto de PCR são essencias. O protocolo de purificação do produto de PCR precisa eliminar todos os dNTPs e os primers que nao foram incorporados durante a PCR. Para esta purificação da PCR, os Kits da linha PureLink™ PCR Purification são muito eficientes. O Kit MicroSEQ™ ID Purification Combo Kit 2 combina a purificação enzimática do produto de PCR (tratamento com Exonuclease I e Fosfatase Alcalina de Camarão) e a purificação da reação de sequenciamento por colunas, e é uma excelente alternativa. A quantificação do produto de PCR é um passos mais críticos, pois para cada tamanho de fragmento que se pretende sequenciar, há uma quantidade indicada de material de partida para a reação de sequenciamento. O sitema Qubit® utiliza o método fluorimétrico para quantificação específica de diferentes moléculas (por exemplo, DNA dupla fita).
Com o produto de PCR purificado e quantificado, você pode realizar a reação de sequenciamento utilizado os Kits BigDye® Terminator Cycle Sequencing Kits v1.1 e v3.1, que são Kits muito estáveis e que fornecem resultados muito consistentes. Você também pode optar pelo Kit BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit, que utiliza primers universais M13 para a reação de sequenciamento, garantindo bons resultados desde as primeiras bases do seu fragmento de interesse, e diminui seu tempo de trabalho, eliminando alguns processos, como a etapa de purificação do produto de PCR.
Para injeção da reação de sequenciamento no sequenciador, é ainda necessário a precipitação da reação, para eliminar os sais e outros resíduos da reação de sequenciamento. Embora os protocolos manuais para essa precipitação geralmente funcionem bem, eles são muito demorados e propensos a erros. Uma excelente opção, para obter melhores resultados e em menor tempo, é o Kit BigDye XTerminator® Purification Kit, com o qual a precipitação é feita em único tubo e sem perda de material e que utiliza módulos de injeção específicos, para evitar que o capilar mergulhe na “sujeira” precipitada.
