A análise de fragmentos através de eletroforese capilar é uma técnica amplamente empregada na pesquisa genética. Essa técnica baseia-se na determinação do tamanho de fragmentos amplificados por PCR, utilizando primers marcados com fluorescência, por comparação com um marcador de tamanho conhecido (size standard). O uso de diferentes fluorescências permite a análise vários fragmentos (lócos) ao mesmo tempo.
Após a PCR, os fragmentos são submetidos a uma eletroforese capilar, nos sequenciadores automáticos de DNA.
As principais aplicações da análise de fragmentos são:
As principais aplicações da análise de fragmentos são:
1. Análise de Microssatélites (regiões repetitivas)
4. Diagnóstico Clínico (KRAS & BRAF)
5. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
6. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
7. Quimerismo
8. ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)
9. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) - The MLPA® procedure from A to Z
10. LOH (Loss of Heterozigozity)
Veja abaixo quais são os principais problemas associados a análise de fragmentos por eletroforese capilar.
1. Picos +A/-A
Durante a PCR muitas polimerases inserem uma adenina no final dos fragmentos. Quando apenas parte dos fragmentos estam adenilados, um pico menor é vizualizado junto ao pico correspondente do fragmento. A estratégia para resolver este problema é forçar a adenilação dos fragmentos, aumentando o tempo de extensão final na PCR.
2. Picos Stutter
Os picos stutter são artefatos resultantes da amplificação dos microssatélites, caracterizados pela presença de uma unidade de repetição mais curta em relação ao alelo principal (frequência de 3-12%). Para um dado loco STR, a probabilidade de stutter geralmente aumenta com o tamanho dos alelos (maior número de unidades de repetição) e com o tamanho da unidade de repetição (em pares de bases). A porcentagem de stutter é proporcional à concentração de cloreto de magnésio (MgCl2) e é muito reprodutível para um determinado alelo.
A quantificação dos picos pode facilitar a interpretação dos resultados quando ocorre sobreposição dos picos com stutters.
3. Allele Drop-out
Drop-out = falha de amplificação de locos/alelos específicos. A possibilidade de ocorrer drop-out aumenta quando se utilizam-se pequenas quantidades de DNA, quando existe algum contaminante inibidor na amostra (ex: hematina, ácido húmico, fenol, etc.), ou quando as amostras estão degradadas ou comprometidas.
4. Sinal muito intenso (Offscale)
A ocorrência de um sinal muito intenso resultante das suas amostras ou do Size Standard pode derrubar os valores de qualidade dos genótipos atribuídos às suas amostras.
Picos com sinais muito intensos são marcados pelo software GeneMapper com uma faixa lilás.
Quando você pretende analisar mais de um marcador em um mesmo ensaio, é também fundamental que a intensidade dos picos de cada marcador seja o mais próxima possível.
Importante (1): Mantenha a temperatura da sala do seu sequenciador sempre constante (próxima 22 °C), principalmente durante as corridas. A oscilação da temperatura pode alterar o padrão de migração das amostras e do Size Standard, interferindo na construção da curva para determinação do tamanho dos fragmentos.
Importante (2): Procure sempre avaliar todas as amostras do seu projeto utilizando o mesmo Size Standard, a mesma plataforma de sequenciamento, o mesmo tipo de polímero e o mesmo comprimento de capliar. Diferentes Size Standards pode levar a obtenção de alelos (tamanhos) diferentes, quando na verdade os alelos são os mesmos. O mesmo pode acontecer quando são utilizados diferentes equipamentos para a eletroforese capilar, quando se muda o tipo de polímero ou o comprimento do capilar. Veja o exemplo da figura abaixo, na qual o mesmo alelo é identificado com tamanhos diferentes em diferentes plataformas:
Para evitar este tipo de erro você pode também utilizar controles positivos com genótipos conhecidos ou uma escada alélica para analisar suas amostras.
4. Sinal muito intenso (Offscale)
A ocorrência de um sinal muito intenso resultante das suas amostras ou do Size Standard pode derrubar os valores de qualidade dos genótipos atribuídos às suas amostras.
Picos com sinais muito intensos são marcados pelo software GeneMapper com uma faixa lilás.
Exemplo de amostra com sinal "estourado".
Para diminuir os problemas de sinal muito intenso, você precisa otimizar a diluição do seu produto de PCR e a quantidade de Size Standard utilizado, para que o sinal não ultrapasse o limiar máximo de detecção do software. Além disso, para aumentar a precisão e a confiabilidade dos seus resultados, procure sempre otimizar o preparo da sua amostra de modo que a intensidade dos picos seja semelhante a intensidade dos picos do Size Standard. Quando você pretende analisar mais de um marcador em um mesmo ensaio, é também fundamental que a intensidade dos picos de cada marcador seja o mais próxima possível.
Teste com diferentes proporções dos marcadores em cada amostra. Em destaque o melhor resultado.
O excesso de primers que não foram incorporados na reação de PCR também pode provocar um "estouro" de sinal, prejudicando as análises. Para resolver este tipo de problema você pode customizar o seu Size Standard, deixando de fora os picos iniciais, geralmente excluindo o pico da posição 35.Importante (1): Mantenha a temperatura da sala do seu sequenciador sempre constante (próxima 22 °C), principalmente durante as corridas. A oscilação da temperatura pode alterar o padrão de migração das amostras e do Size Standard, interferindo na construção da curva para determinação do tamanho dos fragmentos.
Importante (2): Procure sempre avaliar todas as amostras do seu projeto utilizando o mesmo Size Standard, a mesma plataforma de sequenciamento, o mesmo tipo de polímero e o mesmo comprimento de capliar. Diferentes Size Standards pode levar a obtenção de alelos (tamanhos) diferentes, quando na verdade os alelos são os mesmos. O mesmo pode acontecer quando são utilizados diferentes equipamentos para a eletroforese capilar, quando se muda o tipo de polímero ou o comprimento do capilar. Veja o exemplo da figura abaixo, na qual o mesmo alelo é identificado com tamanhos diferentes em diferentes plataformas:
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Veja abaixo uma descrição de alguns componentes e problemas que podem estar associados a falha destes componentes:
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Considerações sobre o Software GeneMapper®
Com o auxílio do software GeneMapper você pode analisar seus dados de microssatélites, SNaPshot, AFLP, LOH, MLPA, entre outros. Durate as análises são verificados componentes de qualidade para cada uma das amostras e para os genótipos associados a estas amostras. Para cada um desses componentes é atribuído um status,
como é visto na figura abaixo,
Veja abaixo uma descrição de alguns componentes e problemas que podem estar associados a falha destes componentes:
OS - Offscale
Este componente é visualizado tanto na aba das amostras como dos genótipos. Entretanto, seu significado difere em cada uma das abas. Na aba das amostras, a falha neste componente está associada ao fato de um ou mais picos do Size Standard terem excedido o limiar máximo de detecção. Já na aba dos genótipos a falha está relacionada à ocorrência de picos da amostra que excedem o limiar máximo de detecção.
A falha no Offscale pode ser corrigida através da diminuição da quantitade de Size Standard ou de amostra no preparo solução a ser levada para o sequenciador.
Importante: o uso de água ao invés de formamida no preparo da solução pode produzir picos artificiais com intensidade elevada.
SQ - Sizing Quality
O Sizing Quality verifica a similaridade entre o padrão de fragmentos especificado para o Size Standard e a distribuição real dos picos do Size Standard na minha amostra. A medida do Sizing Quality é a combinação de valores que medem o sucesso de alguns algorítmos, como os utilizados para a construção da curva “size-calling” do Size Standard, a partir da qual o tamanho dos fragmentos pode ser determinado. O valor de SQ varia de 0 a 1 e, de acordo com o threshold definido nas configurações do nosso método de análises, pode passar ou falhar.
Problemas neste componente podem ser resolvidos através da otimização da quantidade de Size Standard utilizado no preparo das amostras e pela utilização de um Size Standard adequado para o DyeSet das amostras e para o tamanho dos fragmentos em análise.
GQ - Genotype Quality
O Genotype Quality é um resumo das medidas de qualidade associadas àquele genótipo. Baixos valores de qualidade nos demais componentes, como para o OS, o SQ, etc, reduzem o valor do Genotype Quality cerca de 50% (fator de correção 0,5). Quando o GQ das suas amostras estiver baixo verifique qual é o processo de qualidade que está causando este problema, para que ele possa ser corrigido.
Boa sorte com suas análises!
Qualquer dúvida deixe sua pergunta.
