Atenção: Tenha o máximo de cuidado possível ao manipular sua solução estoque de primer. Utilize sempre materiais limpos e livres de qualquer possível contaminação.
Para evitar perdas de primer, centrifugue sempre o seu primer liofilizado, por aproximadamente 5 minutos, antes de abrir o tubo.
O uso de tampão Tris-EDTA (TE pH 8,0) para ressuspender a solução estoque pode aumentar a estabilidade e vida útil dos seus primers.
Metodologia para diluição de primer
Primer liofilizado: Com base no número de moles específico para cada primer (quantidade), deve-se calcular o volume de água deionizada ou tampãoTE que deve ser adicionado.
V= ηmolx1000
Cf
V= Volume (em µL) que deverá ser adicionado no tubo de primer liofilizado
ηmol = quantidade de primer na escala em ηmol (muitas vezes a quantidade de primer vem especificada como ρmol, que equivale a 10-3 ηmol).
Cf= Concentração final desejada.
Exemplo: Primer W: n° de moles = 38,4 ηmoles e concentração final de 200 µM.
V = 38,4x1000
200
V= 192 µL de água deionizada
Obs. µM é igual a ρmol/µL, por isso é necessário multiplicar a quantidade em ηmoles por 1000 (1 ηmol = 1000 ρmoles).
Obs. µM é igual a ρmol/µL, por isso é necessário multiplicar a quantidade em ηmoles por 1000 (1 ηmol = 1000 ρmoles).
Como fazer uma solução de trabalho
Utilize a fórmula:
C1xV1=C2xV2
C1 - concentração da solução estoqueV1 - volume a ser pipetado da solução estoque
C2 - concentração desejada da solução de trabalho
V2 - volume desejado da solução de trabalho
Exemplo: Para preparar 100 µL de solução de trabalho, a 20 µM, a partir de uma solução estoque de 200 µM, faça:
V1 = 20µMx100µL
200µMx
V1 = 10 µLPortanto, você deve diluir 10 µL da sua solução estoque em 90 µL de água deionizada.
Obs.: Tampão TE em alta concentração pode funcionar como inibidor para a PCR. Dessa forma, indicamos que você utilize água deionizada para preparar a solução uso dos seus primers.
