Seu sequenciador faz muito mais que sequenciar. A Análise de Fragmentos através de eletroforese capilar é uma técnica que permite a detecção do tamanho de fragmentos amplificados por PCR, utilizando iniciadores marcados com fluorescência. Esta técnica é usualmente empregada na análise de microssatélites, para os estudos de identificação de marcadores moleculares de doenças, estudos populacionais, determinação de paternidade, genética forense, etc. A eletroforese capilar substitui sistemas de detecção como os géis de poliacrilamida e até mesmo o gel de agarose, facilitando e simplificando o trabalho através de um sistema automatizado para a eltroforse e um conjunto de softwares para análise dos resultados, diminuindo os vieses associados à análise de fragmentos.
Muitas outras técincas utilizam a análise de fragmentos como princípio, como por exemplo, o SNaPshot, usada na genotipagem de SNPs. Os SNPs são polimorfirmos de nucletídeo único, cuja frequência, no genoma humano, é de cerca de 1 a cada mil pares de base. Muitos SNPs contribuem para as diferenças fenotípicas interindividuais, susceptibilidade a doenças e a resposta ao uso de medicamentos (farmacogenômica e famacogenética).
Fig. Princípio da técnica de SNaPshot
A técnica de SNaPshot® é baseada na extensão de um único nucleotide marcado com fluorescência (ddNTP), utilizando iniciadores não marcados. Nesta técnica, a região contendo o(s) SNP(s) a serem avaliados é amplificada por PCR e o produto de PCR é submetido a uma reação de SNaPshot, na qual um primer hibridiza na região justaposta ao SNP e o dideoxinucleotídeo (ddNTP) complementar é incorporado pela polimerase. Após a reação de SNaPshot o produto é misturado com a formamida e o size standard e submetido á eletroforese capilar para identificação do ddNTP incorporado. Através desta técnica, é possível genotipar até 10 SNPs previamente descritos em uma reação multiplex. Os primers para os doferentes SNPs diferem em tamanho através da adição de uma cauda (poli A, poli T, etc) à extremidade 5`. O genótipo de cada SNP é determinado pela cor observada, após a reação de SNaPshot.
Fig. Exemplo de dado de SNaPshot®
O SNaPshot é uma técnica robusta, que utiliza o princípio do sequenciamento de Sanger (incorporação de um ddNTP pela DNA polimerase), e que permite ao pesquisador analisar mais de 23 mil SNPs por dia em uma única plataforma 3730xl.
Análises de BAC fingerprinting e metilação também podem ser realizadas usando o sistema SNaPshot ®.
Além disso, a Análise de Fragmentos também é utilizada em outras aplicações como: AFLP, MLPA, Perda de Heterosigozidade (LOH), T-RFLP, SSCP, etc, que são usadas em diferentes áreas da pesquisa e diagnóstico clínico, confira no site da Life Technologies:
Sample Type | Research Type | Diagnostic Tool |
AFLP é uma técnica de alta sensibilidade na qual o DNA genômico do organismo de interesse é digerido com enzimas de restrição e ligado a adaptadores para posterior amplificação utilizando primers que são complementares aos adaptadores e que são marcados com uma fluorescência. Através dessa técnica é possível identificar padrões de bandas (fingerprints) para um determinado indivíduo, dado que pode ser usado, por exemplo, para uma comparação com o perfil observado em outros individuos, com o intuito de determinar o grau de parentesco entre os mesmos. Alem disso os dados de AFLP também podem ser usados para monstar mapas genéticos de novas espécies, estudos moleculares filogenéticos, estudos de ligação, etc.
Fig. Workflow da técnica de AFLP
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) é uma técnica de PCR multiplex, que utiliza o princípio da análise de fragmentos para avaliação dos resultados. Muito usada no estudo de disturbios congenitos e hereditários que envolvem variações no número de cópias de alguns genes, como as sindromes, essa técnica baseia-se na hibridização e ligação de sondas alvo-específicas, seguida pela amplificação por PCR usando primers marcados com fluorescência, que são complementares a sonda. Essa técnica também é usada em estudos de metilação do DNA, quantificação de RNA mensageiro (mRNA), perfil tumoral, etc.
Fig. Workflow da técnica de MLPA
Leia mais sobre os fundamentos da análise de fragmentos e tenha acesso a literatura especializada no site: Fragment Analysis - Life Technologies
Para mais informações sobre a técnica de MLPA, visite o site da MRC-Holland, detentora da patente desta tecnologia: MLPA - MRC-Holland
Olá, gostaria que tirasse minha dúvida, se puder..no laboratorio onde trabalho o equipamento é usado para sequeciamento e esta calibrado com o padrao de matriz DS 30. Preciso calibra-lo com outro padrao de matriz, DS 32, para poder utilizar para genotipagem com microssatelites.Porém eu tenho que calibrar toda vez que eu for usar ou para sequenciamento ou para genotipagem???
ResponderExcluirOi Rafaelle,
ExcluirUma vez feitas, todas as calibrações espectrais ficam salvas no seu sequenciador e ele reconhece automaticamente na hora de você correr uma placa de sequenciamento ou uma placa de analise de fragmentos. Não precisa refazer toda vez não. Nós apenas recomendamos que você refaça as calibração pelo menos a cada seis meses (se nada mudar no sequenciador).
Muito obrigada Ricardo!! E parabéns pelo seu blog, aprendi muito com ele!
ResponderExcluirOlá, estou começando a trabalhar com teste de paternidade animal pela técnica de análise de fragmentos, e apesar de conhecer a técnica na teoria tenho muitas dúvidas na aplicação. Dúvidas desde a etapa inicial como tamanho e marcação dos primers até a análise final dos resultados! Você sabe me dizer se o curso de análise de fragmentos oferecido pelo centro de treinamento me ajudaria nestas dúvidas?Ou ele seria mais aplicado á manipulação do equipamento?
ResponderExcluirOlá.
ResponderExcluirAcho que o curso de Análise de Fragmentos será muito esclarecedor para as suas dúvidas. Neste curso nós vemos um pouco do equipamento, como configurá-lo para correr uma placa de análise de microssatélites, mas o enfoque principal é na teoria, análise e discussão de resultados.
Escreva para nosso centro de treinamento, que a Viviane (centrodetreinamento.br@lifetech.com) terá o maior prazer em esclarecer todas as suas dúvidas.
Obrigado pelo interesse.
Ricardo
Olá Ricardo, muito obrigada pela resposta. Vou escrever para a Viviane!
ResponderExcluirBoa noite,
ResponderExcluirestava lendo um artigo sobre análise de fragmentos e o autor desenha os primers F marcados com fluoróforo e nos primers R ele adiciona uma cauda (7pb AB tail sequences - Applied Biosystems; P/N: 4304979). Você sabe me dizer qual é a função dessa cauda?
Obrigada
Olá Marcos,
ResponderExcluirDesculpe não responder antes. Essa cauda adicionada a um dos primers pode servir para aumentar o tamanho dos amplicons um pouquinho e você conseguir separar dois fragmentos de PCR que tem tamanho muito próximo, sem precisar trocar o tipo de fluoróforo, por exemplo.
Outras aplicações de caudas ligadas aos primers, podem ser, por exemplo a incorporação de uma sequencia M13, que servirá como molde para a hibridização d eum primer de sequenciamento. Se você trabalha com regiões repetitivas você pode usar a sequência do da cauda do primer para fazer um primer walk. E outras aplicações ainda.
É sempre você que escolhe a sequência dessa cauda, então você pode faze-la (de forma customizada) um pouco maior, um pouco menor e com as características que você quer.
Esse exemplo de uma caudinha com 7pb, que é o que você viu nesse artigo, provavelmente serviu apenas para dar uma tamanho um pouco maior ao amplicon. Sem nenhuma outra aplicação direta. Mas se você quiser me mandar o artigo que você leu, posso dar uma olhadinha.
Meu e-mail: Ricardo.DallaCosta@lifetech.com
Escreva sempre que precisar,
Ricardo
Olá, estou com uma dúvida básica, já li bastante, mas ainda ela persiste.
ResponderExcluirO Snapshot é uma reação pós sequencimanto?