terça-feira, 17 de maio de 2011

Você sequencia?

Quais são as aplicações do sequenciador no seu laboratório? Seu ABI faz muito mais que sequenciar.

O primeiro método de sequenciamento de DNA foi desenvolvido entre os anos de 1976 e 1977, pelos químicos Allan Maxam e Walter Gilbert, e baseava-se no tratamento do DNA, extraído do organismo ou célula de interesse, com substâncias químicas que clivavam a molécula em sítios específicos, dependendo da sua constituição de bases. 

A descoberta da estrutura do DNA em 1953, por Francis Crick e James Wattson, a partir da qual foi proposto um mecanismo fiel para cópia do material genético, serviu como base para o desenvolvimento de técnicas moleculares consagradas, como a PCR e o método enzimático de sequenciamento. 

Esse método de sequenciamento, desenvolvido por Frederick Sanger em 1977, e que lhe rendeu o prêmio nobel de química em 1980, baseia-se na terminação da cadeia crescente de DNA e utiliza dideoxinucleotídeos (ddNTPs), que quando são incorporados na fita de DNA, pela polimerase, interrompem o seu alongamento. Esses ddNTPs diferem dos deoxinucleotídeos normais (dNTPs) por possuírem um radical H ligado ao carbono 3 da pentose (açucar associado à molécula de DNA), enquanto os dNTPs possuem um radical OH nesta posição. Inicialmente os ddNTPs eram marcados com isótopos radiotaivos (32P ou 35S), que permitiam a sua detecção quando expostos a um raio X. 

A descoberta das moléculas fluorescentes, no final dos anos 1980, e o desenvolvimento dos sequenciadores automáticos de DNA, levaram a automatização da técnica de sequenciamento e a sua utilização em pesquisas nos mais variados campos das ciências biológicas. Atualmente, com todas as suas variações, o sequenciamento é uma das técnicas mais utilizadas não apenas na pesquisa, mas também no diagnóstico de doenças e condições fisiológicas e na identificação de patógenos.

Quais as linhas de pesquisa do seu laboratório? Você explora todas as possibilidades do seu sequenciador ABI? Veja abaixo as aplicações testadas e validadas para nossas plataformas de sequenciamento. Siga o link de cada plataforma e verifique em detalhes as suas especificações e aplicações.
Plataforma


3730xL

3730

3500xL

3500

3130xL

3130

310
Número de Capilares
96
48
24
8
16
4
1
Aplicações compatíveis:
(V) Validado; (A) Demonstrado pela AB; (C) Demonstrado por clientes; (N) Não suporta
BAC End Sequencing
V
V
V
V
V
V
V
Checking Clone Constructs
V
V
V
V
V
V
V
De NovoSequencing
V
V
V
V
V
V
V
Heterozygote Detection & Resequenicng (SNP-based)
V
V
V
V
V
V
A
HLA Typing
V
V
V
V
V
V
C
Methylation
V
V
V
V
V
V
C
mtDNA Sequencing
V
V
V
V
V
V
V
Resequencing
- Comparative Genomics
V
V
V
V
V
V
V
- Indels
V
V
V
V
V
V
V
SAGE™ Method
C
C
C
C
C
C
A
SNP Analysis
V
V
V
V
V
V
V
General Sizing of PCR Products
V
V
V
V
V
V
V
Fragment Length Polymorphism
- AFLP
V
V
V
V
V
V
V
- RFLP
A
A
A
A
A
A
A
Large Fragment Analysis
- BAC Fingerprinting
A
A
A
A
A
A
N
- VNTR
C
C
C
C
C
C
C
Microsatellite
- Genotyping
V
V
V
V
V
V
V
- Analysis for Forensics/HID
N
V
V
V
V
V
V
- Instability/RER
A
A
A
A
A
A
A
Chimerism Studies
C
C
C
C
C
C
C
Conformation Analysis
- SSCP
N
N
N
N
A
A
V
Relative Flourescent Quantitation
- Loss of Heterozygosity (LOH)
V
V
V
V
V
V
V
SNP Genotyping
- SNaPshot® System
A
A
V
V
V
V
V
- SNPlex™ System
V
V
V
V
V
N
N
DNA Protein Binding Assays & DNA Fingerprinting
C
C
C
C
C
C
C

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Postado por às

2 comentários:

  1. Morgana2 de novembro de 2012 às 16:21

    Oi! Estou inicando sequenciamento e os picos ficam sorepostos como na sua figura representando inespecificidade. Sabe como posso resolver?
    Outro ponto importante, é quanto a análise dos dados. Uso o X-terminator para purificação. Vi no seu 'review' que pode ser o algoritmo usado. Onde verifico o "basecaller" e o "mobility file"? O sequenciador que uso não permite que usuários de outros setores manuseie-o, logo não tenho permissão, porém utilizo com a supervisão de um chefe local (só ele manuseia). Mas posso ver esses algoritmos com ele, de repente estão infulenciando na qualidade do sequenciamento.
    Agradeço muito se você puder ajudar.
    Abraço,
    Morgana

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  2. Ricardo Dalla Costa6 de novembro de 2012 às 07:59

    Ola Morgana,
    Desculpe a demora em responder, estava de ferias e em treinamento logo depois.
    Você pode me mandar por email alguns desses arquivos (.ab1) do seu resultado? Ricardo.DallaCosta@lifetech.com

    Qual software você usa para abrir os seus dados? Você só tem acesso aos algoritimos se usar os softwares da Life Technologies. Uma opção gratuíta é o Sequence Scanner. Você pode fazer o download dele aqui: http://lifesequencing.blogspot.com.br/2012/08/software-sequence-scanner.html
    Entretanto, ele não permite você alterar os algorítimos. Eles precisam ser definidos corretamente la no data collection do sequenciador, ou no software sequencing analysis. Assim que você me mandar or arquivos eu dou uma olhada e te digo se os algoritimos estão corretos ou não. Se não estiverem, eu te mostro como você faz pra corrigir isso la no sequenciador. Se eles não estiverem errados, eu te dou algumas dicas de como melhorar o seu resultado.

    Qual sequenciador você esta usando e qual kit de sequenciamento (BigDye v3.1 ou v1.1)?

    Atenciosamente,

    Ricardo

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